人恶性黑色素瘤细胞WM115培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：人恶性黑色素瘤细胞WM115
生长特性：贴壁
冻存条件：无血清冻存液
培养体系：MEM+10%FBS+1%P/S
传代方法：首次建议1:2传代
传代情况：每2天更换培养基
备注：使用无菌离心管收集培养基，以便进行对比培养。如对比结果不理想，建议直接购置俄罗斯专享会294的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

收到细胞后，将其培养至良好状态后，灌满完全培养液并封好瓶口，这样可以确保细胞在运输后的存活率。首先，使用75%酒精对整个细胞瓶进行喷洒消毒，然后在超净台中进行严格无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态后再进行下一步处理。通过显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照记录（建议记录40x, 100x, 200x各一张）。前三天的照片将作为售后支持的重要依据，如未提供照片将默认收到状态良好。在传代后，建议一瓶继续使用原瓶的完全培养基，另一瓶则使用自配的完全培养基进行对比实验，换液后可将瓶盖轻微松开。

三、细胞培养步骤

a、细胞传代：

在细胞汇合度未超过80%时，将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，放入37℃、5%CO2孵箱维持培养；在细胞密度超出80%时则需进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，并用不含钙、镁的PBS清洗细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞在显微镜下的状态，若细胞大部分变圆并脱落，赶紧取回操作台，轻轻敲击培养瓶后加入5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后，吸出并转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清，补充1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，然后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。

b、细胞冻存：

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察变圆后加入5ml完全培养液终止反应，吹打以使细胞脱落，再转移至15ml离心管中，在1000rpm条件下离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，如需后期转入液氮罐中，需在-80℃冰箱存放24小时以上再转入。

c、细胞复苏：

1. 从液氮中取出冻存管（佩戴防护面具），快速置入37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶，然后用75%酒精擦拭外壁。
2. 将细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，进行1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放入37℃、5%CO2培养箱中。
4. 第二天更换新鲜完全培养基并继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，有些细胞可能会因附着不牢而脱落，这属于正常现象。如脱落情况较多，可将培养液收集至离心管中，1000rpm离心5分钟，收集上清进行过渡培养。沉淀后加入胰酶1-2ml，轻轻吹打，重悬后消化1-2分钟，再加入5ml完全培养基终止反应，旋转离心并重悬。最终以1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充完全培养基后放入细胞培养箱中培养。

五、售后条款

1. 如细胞出现问题，重发的情况包括：
- 运输过程中细胞丢失、瓶身破损或培养液严重漏液，需重发；
- 收到产品48小时内如出现污染，提供真实实验结果经核实后重发；
- 常温发货细胞在24小时后，干冰发货细胞复苏后24小时内未存活，需提供清晰照片，才可重发；
- 收到细胞后2-3天需拍照记录，若超出3天未通报，将视为合格。

补充条款包括：客户造成污染、不正确操作、使用非推荐培养体系等情况不予重发。具体责任将视情况而定。

我们致力于为您提供优质的俄罗斯专享会294细胞培养服务，以确保您实验的成功与顺利。